腺病毒介导RNA干扰抑制核心结合因子α1表达阻断软骨细胞的肥大分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.02.005

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (2): 187-191.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.02.005

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腺病毒介导RNA干扰抑制核心结合因子α1表达阻断软骨细胞的肥大分化

高博¹，幸嵘²，孔清泉²，项舟²，杨婧²，蔡加琴³，黄益州³，李秀群³，陈晓禾³

1德阳市人民医院骨科，四川省德阳市 618000；2四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041；3四川大学华西医院，生物治疗国家重点实验室•干细胞与组织工程研究室，四川省成都市 610041

收稿日期:2014-12-22 出版日期:2015-01-08 发布日期:2015-01-08
通讯作者: 孔清泉，博士，硕士生导师，四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041
作者简介:高博，男，1984年生，四川省天全县人，汉族，2011年四川大学华西临床医学院毕业，硕士，医师，主要从事骨与关节损伤研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(30700837)；国家自然科学基金面上资助项目(30973049)

Adenovirus-mediated RNA interference against core binding factor alpha 1 inhibits the hypertrophic differentiation of chondrocytes

Gao Bo¹, Xing Rong², Kong Qing-quan², Xiang Zhou², Yang Jing², Cai Jia-qin³, Huang Yi-zhou³,Li Xiu-qun³, Chen Xiao-he³

1Department of Orthopedics, People’s Hospital of Deyang City, Deyang 618000, Sichuan Province, China; 2Department of Orthopedics, West China School of Medicine/West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; 3State Key Laboratory of Biotherapy•Laboratory of Stem Cells and Tissue Engineering, West China School of Medicine/West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2014-12-22 Online:2015-01-08 Published:2015-01-08
Contact: Kong Qing-quan, M.D., Master’s supervisor, Department of Orthopedics, West China School of Medicine/West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Gao Bo, Master, Physician, Department of Orthopedics, People’s Hospital of Deyang City, Deyang 618000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30700837, 30973049

摘要/Abstract

摘要：

背景：软骨细胞肥大分化是软骨内骨化启动的标志，也是软骨内骨化必不可少的步骤，它是一种级联反应，一旦启动就很难阻断，最终结果是形成骨骼结构。RNA干扰技术是一种转录后水平的基因沉默，相关研究显示采用RNA干扰技术阻断核心结合因子α1表达能够有效地抑制异位骨化形成。
目的：利用RNA干扰技术抑制核心结合因子α1表达，从而阻断大鼠软骨细胞肥大分化。
方法：构建沉默SD大鼠核心结合因子基因的腺病毒Ad-Cbfa1-siRNA。利用维甲酸及白细胞介素1α促进软骨细胞肥大分化，观察Ad-Cbfa1-siRNA对核心结合因子α1表达的抑制作用。利用核心结合因子α1免疫组化方法比较各组核心结合因子α1的表达从而分析软骨细胞的肥大分化情况。
结果与结论：经维甲酸和白细胞介素1α诱导后，阴性对照病毒组软骨细胞出现肥大分化，核心结合因子α1的表达呈阳性反应；Ad-Cbfa1-siRNA组软骨细胞中未见核心结合因子α1明显表达。提示利用RNA干扰技术能够明显抑制核心结合因子α1的表达，从而阻断软骨细胞的肥大分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 软骨细胞肥大分化, 核心结合因子, RNA干扰, 腺病毒, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hypertrophic differentiation of chondrocytes is the sign of starting endochondral ossification, and it is also an essential step in endochondral ossification, which is a cascade reaction and difficult to be blocked once started. The end result is the formation of bone structure. RNA interference is a post-transcriptional gene silencing. Relevant studies have shown that the use of RNA interference to block the expression of core binding factor α1 (Cbfα1) can effectively inhibit the formation of heterotopic ossification.
OBJECTIVE: To use RNA intereference technology to suppress Cbfα1 expression so as to achieve the purpose of blocking the hypertrophic diferentiation of chondrocytes.
METHODs: We constructed an adenovirus containing siRNA against Cbfα1 (Ad-Cbfα1-siRNA). Retinoic acid and interleukin-1α were used to induce hypertrophic differetiation of chondrocytes, and then Ad-Cbfα1-siRNA was utilized to inhibit the hypertrophic differentiation of chondrocytes. Immunohistochemistry method was used to analyze the expression of Cbfα1.
RESULTS AND CONCLUSION: After induction with retinoic acid and interleukin-1α, the chondrocytes in the negative control virus group appeared to have hypertrophy and the expression of Cbfα1 was positive. In the Ad-Cbα1-siRNA group, the expression of Cbfα1 was negative. These findings suggest that the inhibition of Cbfα1 by RNA interference can be a powerful way to prevent the hypertrophic differentiation of chondrocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Chondrocytes, Core Binding Factors, RNA Interference, Adenoviridae

中图分类号:

R318

高博，幸嵘，孔清泉，项舟，杨婧，蔡加琴，黄益州，李秀群，陈晓禾. 腺病毒介导RNA干扰抑制核心结合因子α1表达阻断软骨细胞的肥大分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(2): 187-191.

Gao Bo, Xing Rong, Kong Qing-quan, Xiang Zhou, Yang Jing, Cai Jia-qin, Huang Yi-zhou,. Adenovirus-mediated RNA interference against core binding factor alpha 1 inhibits the hypertrophic differentiation of chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(2): 187-191.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：观察学实验。

时间及地点：于2009年1月至2010年12月在四川大学组织工程与干细胞实验室完成。

材料：SD大鼠由四川大学华西动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

腺病毒介导的RNA干扰抑制核心结合因子α1表达实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体、兔抗鼠Ⅹ型胶原抗体、兔抗鼠核心结合因子α1抗体	北京博奥森生物技术有限公司
SABC免疫组织化学试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒	北京中杉金桥生物技术有限公司
YU2200 型超净工作台	Jouan 公司，法国
倒置相差显微镜及照相系统	Olympus，日本
CO₂培养箱	Sanyo，日本
Eppendorf 5702台式低速离心机	德国
低温高速离心机	Heraeus，美国
LEICA2125型石蜡切片机	-

方法：

构建沉默SD大鼠核心结合因子α1基因的腺病毒Ad-Cbfa1-siRNA：利用Ambion的siRNA在线设计工具设计SD大鼠核心结合因子a1特异的小分子干扰RNA序列，使用BLAST排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。由武汉市晶赛生物工程技术有限公司人工合成靶向核心结合因子a1的小分子干扰RNA序列。将筛选出的小分子干扰RNA序列克隆到质粒上面，经酶切分析，序列符合要求，正确插入质粒。然后与腺病毒在细菌中进行同源重组，然后转染HEK293细胞进行扩增。

软骨细胞体外扩增及鉴定^[3]：

软骨细胞采集：取7-10 d龄的SD大鼠，放入碘伏溶液中消毒5 min，体积分数75%乙醇脱碘3 min，取双侧股骨髁关节软骨，操作时仔细剥离关节边缘的滑膜。切取厚度为约为1 mm，不超过软骨下骨板，软骨片切成约2 mm×2 mm大小，将切取的软骨片置于磷酸盐缓冲液中(含双抗液)。

软骨细胞悬液的制备：在超净台内用PBS冲洗取下的软骨片3遍，仔细将附带的软组织去除干净，移入青霉素小瓶内，加入5倍量的0.25%胰蛋白酶液37 ℃下振荡消化 30 min。移出胰蛋白酶液，使用干净无菌的眼科剪将关节软骨剪碎，加入0.2%Ⅱ型胶原酶10 mL，37 ℃下消化4 h。将消化的细胞悬液经200目金属滤网滤过并移至离心管内，离心(1 200 r/min，5 min)。弃出上清液，加入5 mL DMEM培养液，充分吹打成细胞悬液。血细胞计数板计数。

软骨细胞单层培养：将4×10⁶个细胞接种于25 cm²培养瓶，加入6 mL DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L、维生素C 50 mg/L)。置于体积分数5%CO₂、37 ℃恒温箱内培养，隔日换液，倒置显微镜下观察软骨细胞的生长情况，当软骨细胞生长至约90%融合时进行传代。

软骨细胞鉴定：软骨细胞爬片甲苯胺蓝染色、番红O染色观以及Ⅱ型胶原免疫组化染色完成软骨细胞鉴定。

诱导软骨细胞肥大分化及鉴定：利用维甲酸(10^-⁵ mol/L)和白细胞介素1α(10 μg/L)促进软骨细胞肥大分化^[4]。X型胶原免疫组化染色对肥大分化软骨细胞进行鉴定。具体方法如下：①将细胞爬片取出，放于染色架上，PBS清洗3次，每次3 min。②加入40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，再次PBS清洗3次，每次3 min。③按1∶50配置体积分数30%H₂O₂与甲醇，加至细胞爬片，避光室温孵20 min，再次PBS清洗3次，每次3 min。④山羊血清与PBS按1∶20振荡混匀，37 ℃孵30 min。⑤吸取血清，兔抗大鼠一抗与PBS按照1:100振荡混匀，实验组加入一抗，空白对照组加入PBS，4 ℃过夜。⑥隔日取出细胞爬片，回温，PBS清洗3次，每次3 min。⑦羊抗兔二抗与PBS按1∶50振荡混匀，加入二抗，37 ℃孵30 min，PBS清洗3次，每次3 min。⑧加入辣根过氧化物酶，37 ℃孵40 min，PBS清洗3次，每次3 min。⑨避光加入DAB显色，约5 min，镜下观察，适时自来水冲洗终止。⑩苏木精复染2 min，自来水冲洗。?体积分数1%盐酸乙醇分色数秒，再次自来水冲洗，镜下观察。?0.25%稀氨水促蓝后自来水冲洗。?体积分数95%，100%，100%乙醇各脱水1次，每次约2 min。?脱水结束后行TO透明10 min。?干燥后封固，镜下观察。

Ad-Cbfa1-siRNA对核心结合因子α1表达的影响：

实验分为3组：Ad-Cbfa1-siRNA组应用SD大鼠Ad- Cbfa1-siRNA感染SD大鼠膝关节软骨细胞；阴性对照病毒组应用阴性对照病毒感染SD大鼠膝关节软骨细胞；正常软骨细胞组提取、培养SD大鼠膝关节软骨细胞，不给予处理。2 d后在3组中加入维甲酸(10^-5mol/L)和白细胞介素1α(10 μg/L)诱导促进软骨细胞肥大分化。

主要观察指标：利用核心结合因子α1免疫组化方法比较各组核心结合因子α1的表达，从而分析软骨细胞的肥大分化情况。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

骨关节炎是全球最常见的肌-骨骼系统慢性退变性疾病之一。其病变特点为关节软骨变性、破坏、软骨下骨硬化、关节边缘和软骨下骨反应增生骨赘形成。其主要的临床表现是疼痛和僵直以及后期的功能障碍。骨关节炎主要发生在65岁以上的老年人，随着年龄的增长骨关节炎的发病率也增加，国内目前正处于人口老龄化的阶段，骨关节炎对国民生活质量将会产生越来越大的影响。

骨关节炎的发病机制尚不是很清楚，是多种致病原因共同作用的结果，多种致病原因形成一种网状的恶性循环反应通路。骨关节炎的发病与细胞外基质降解酶，如基质金属蛋白酶13等、软骨细胞代谢失调、软骨细胞凋亡、软骨细胞肥大分化以及滑模和关节囊的变化等因素密切相关。软骨和软骨下骨通过钙化层介导发生相互作用贯穿整个骨关节炎病程^[5]。针对以上这些不同的病因，研究者对骨关节炎的预防和治疗进行了大量的研究。

软骨细胞肥大分化在骨关节炎的发病中起着很重要的作用。核心结合因子是软骨细胞肥大分化的重要调控因子，它主要分布在肥大软骨细胞和成骨细胞中^[6]。相关研究显示骨关节炎早期就会出现核心结合因子α1表达增高，随后出现X型胶原和碱性磷酸酶活性增强，最后导致细胞外基质钙化以及软骨细胞终末分化^[7]。软骨细胞肥大分化是软骨内骨化启动的标志，也是软骨内骨化必不可少的步骤，它是一种级联反应，一旦启动就很难阻断，最终结果是形成骨骼结构。

RNA干扰生物体内普遍存在，1995年RNA干扰现象首次在线虫中被发现^[7]。1998年RNA干扰的概念首次被提出^[8]。RNA干扰是通过小分子干扰RNA片段与一个核酶结合形成的RNA诱导沉默复合物来切割mRNA，从而发挥基因沉默的作用。它是一种转录后水平的基因沉默，能够有效地沉默目的基因的表达。RNA干扰针对的是靶基因的外显子序列，具有高特异性和高效性，现已广泛地应用于科学研究中，是目前比较热门的方向之一。

RNA干扰技术已应用于肿瘤、感染、神经病变以及眼内疾病等一些人类疾病的研究中^[9]。另外，RNA干扰也用于类风湿关炎、异位骨化、Ewing’s瘤等一些骨科相关疾病的研究中^[2^，^10-12]。同样，RNA干扰技术也被用于治疗骨关节炎的研究中，Lianxu等^[13]利用核因子κB p65特异的小分子干扰RNA片段能够抑制大鼠中COX-2、NOS-2、MMP-9的表达，这样就为早期骨关节炎的治疗提供了一种方式。

在骨关节炎的致病原因中，软骨细胞的肥大分化起着非常重要的作用。而软骨细胞的肥大分化可由多种原因造成。异常的力学信号通过促进软骨细胞的肥大分化^[14]，从而导致骨关节炎的发生。也有研究显示，Ⅱ型胶原碎片能够作为生物活性分子促进软骨细胞肥大分化^[15]。Tcheina等^[16]研究显示，变性的Ⅱ型胶原片段能够在软骨细胞的肥大分化以及骨关节炎的病变中起着重要作用，同时在实验中还观察到了MMP-13表达量的增加和细胞凋亡。活性氧簇水平的升高同样能够促进软骨细胞的肥大分化^[17]。白细胞介素8和人生长调节癌基因α可以增加X胶原、MMP-13以及碱性磷酸酶活性，从而促进软骨细胞肥大分化^[18]。Guo等^[19]研究显示，Wnt/β-Catenin信号通路通过抑制PTHrP信号来促进软骨细胞的肥大分化。

在核心结合因子a1(-/-)的鼠模型中，软骨发育正常，但是软骨细胞肥大分化受到抑制，软骨细胞不能分化成熟^[20]。相关的研究显示，软骨细胞中过量表达核心结合因子a1会导致软骨细胞肥大分化^[21]。在膝关节不稳的动物模型中，核心结合因子a1能够促进软骨细胞的肥大分化和细胞基质的降解，从而促进骨关节炎的发病^[15]。

既然软骨细胞肥大分化在骨关节炎的发病中起到了很重要的作用，那么从理论上讲如果能够阻止软骨细胞发生肥大分化或者阻断软骨细胞进一步发生肥大分化，甚至使已经发生肥大分化的软骨细胞逆转为正常的软骨细胞，这样就能够起到预防和治疗骨关节炎的目的。Zheng等^[22]的研究显示，Filamin B能够抑制Runx2的活性，从而减轻软骨细胞的肥大分化。

X型胶原在软骨内成骨过程中始终表达，是肥大分化软骨细胞的特性标志分子。在骨关节炎的早期就会出现Ⅹ胶原的表达。在本研究中，作者采用维甲酸和白细胞介素1α来促进SD大鼠膝关节软骨细胞肥大分化，经免疫组化染色提示可见较多表达，完成软骨细胞肥大分化的鉴定。

查阅文献，尚未见利用RNA干扰技术抑制核心结合因子a1表达，阻断软骨细胞肥大分化来预防和治疗骨关节炎的报道。而且从理论上讲，阻断软骨细胞肥大分化对骨关节炎的预防和治疗会有很好的效果，能够延缓疾病进展。在此基础上，作者采用RNA干扰技术来研究其能否有效抑制核心结合因子a1的表达来预防软骨细胞的肥大分化，从而预防骨关节炎的发生。在本研究中，采用腺病毒作为小分子干扰RNA载体，其可以直接高效率感染细胞进行目的基因的沉默，转染效果更加稳定，相比较质粒转染能够更好地提高转染效率。

实验中单纯软骨细胞组及阴性对照病毒组经维甲酸和白细胞介素1α诱导后出现明显的肥大分化，而Ad-Cbfa1- siRNA转染软骨细胞后，经维甲酸和白细胞介素1α诱导后没有出现明显的肥大分化，核心结合因子a1免疫组化然色未见明显阳性反应，说明利用RNA干扰技术能够很好地抑制核心结合因子a1的表达，从而阻断软骨细胞肥大分化。

本实验为临床预防骨关节炎的发生及骨关节炎治疗提供一个新的研究方向，但是实验中尚缺少分子蛋白水平的检测，这将是下一阶段研究的重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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